1927年7月中旬，党中央任命周恩来为南昌起义的前敌委员会书记，进行部署和领导南昌起义。7月25前后，周恩来及起义的其他领导人如贺龙、叶挺、刘伯承等，从武汉、九江等地到达南昌与朱德会合，进行起义的准备工作。这时集结到南昌的参加起义的兵力大约有2万余人。起义部队的主力，是以贺龙率领的国民革命军第20军，叶挺率领的国民革命军第11军24师和朱德率领的第五方面军第三军官教育团和南昌公安局两个保安队等。7月31日晨，周恩来及前委其他领导成员否定了张国焘阻止起义的错误意见，决定8月1日凌晨4时举行起义，后因一个姓赵的营长叛变，起义提前到凌晨2时。

1927年8月1日凌晨两点，南昌起义的枪声打响。周恩来、贺龙、叶挺、朱德、刘伯承等率领党直接掌握和影响的军队两万余人在南昌宣布起义。经过五个小时的激战，全歼守敌，胜利占领南昌城。起义胜利后，随即成立了以共产党人为领导核心，有国民党左派人士参加的中国国民党革命委员会。8月3日至7日，起义军按预定计划相继撤离南昌，取道临川、宜黄、广昌南下，宣布继承北伐革命没完成的事业，反对帝国主义，打倒新旧军阀，实行“耕者有其田。”8月下旬占瑞金，克会昌，打垮堵截的国民党军队钱大钧部。9月上旬，进军长汀、上杭，中旬占大埔县的三河坝。随后分兵，由朱德率二十五师留守三河坝，总指挥部率主力进军潮州、汕头。下旬，占领潮汕后第二次分兵，一部留守潮汕，主力西取惠州。9月底10月初，起义军在汤坑，三河坝遭到优势敌人的攻击，激战数日，损失严重，潮州、汕头亦相继失守。随后，主力又在流沙一带遭敌截击。所留部队，一部约1200人由颜昌颐、董朗率领进入海陆丰地区；一部约2000人，由朱德、陈毅率领进入湘粤赣边开展游击战争。

南昌起义标志着中国共产党独立承担领导中国革命责任的开始，是中国共产党独立领导武装斗争，创建人民军队的开始。